Luận án tiến sĩ của NCS Nguyễn Mạnh Thắng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những thập kỷ gần đây, các nghiên cứu về cây cỏ thực vật có khả năng hỗ trợ trong phòng và điều trị bệnh đái tháo đường và biến chứng đái tháo đường đang ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., họ thầu dầu  (Euphorbiaceae), một loại cây mọc hoang dại nơi vùng đất ẩm ở các nước nhiệt đới, trong đó có các tỉnh phía nam Việt Nam. Khảo sát thực tế cho thấy, Bình Dương là một tỉnh có điều kiện thời tiết, thổ nhưỡng rất phù hợp cho sự phát triển của các cây thuộc họ thầu dầu. Nhiều nghiên cứu trên Thế giới như Ấn Độ, Malaysia, Nhật Bản đã cho thấy tác dụng của cây cỏ sữa đối với bệnh đái tháo đường thông qua cơ chế kiểm soát glucose máu, ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase bởi hợp chất flavonoid có trong loài thảo dược này. Ở nước ta cho đến nay, còn thiếu những nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về cây cỏ sữa lá lớn phát triển tự nhiên để đưa nguồn dược liệu này ứng dụng sản xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1.    Mô tả được đặc điểm thực vật và xác định một số thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn.

2.    Điều chế và đánh giá được tính an toàn, hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu.

3.    Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất đồ uống dinh dưỡng từ cao cỏ sữa lá lớn dùng trong kiểm soát glucose máu

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật và phân tích một số thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn.

2. Nghiên cứu quy trình điều chế cao từ cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu.

3. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất đồ uống dinh dưỡng từ cao cỏ sữa lá lớn dùng trong kiểm soát glucose máu

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.    Nguyên liệu chính

Phần trên mặt đất cây cỏ sữa lá lớn được thu hái tại tỉnh Bình Dương, được phơi khô đến độ ẩm  ≤ 11%, cắt thành các đoạn dài 4-6 cm và được bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát. Thời gian từ khi thu hái đến khi đưa vào thí nghiệm tối thiểu là 30 ngày. Từ nguyên liệu này, tác giả đã tiến hành điều chế cao cỏ sữa lá lớn. Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng một số nguyên liệu khác như: Mật ong; Cao sâm; Chất tạo ngọt; Quế; Gừng; Nước và bao bì dạng lon nhôm.

2.    Địa điểm nghiên cứu

Sau khi trực tiếp khảo sát thực tế nguồn cỏ sữa lá lớn phát triển tự nhiên tại Bình Dương, nghiên cứu sinh đã thu hái cỏ sữa lá lớn tươi (nguyên rễ), rửa sạch và vận chuyển ra Hà Nội để tiến hành các thí nghiệm. Tác giả đã thực hiện các nghiên cứu: Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn tại Bộ môn Dược liệu thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội; Điều chế cao cỏ sữa lá lớn tại Khoa Hóa Thực vật thuộc Viện Dược liệu; Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn tại Khoa Dược lý Sinh hóa thuộc Viện Dược liệu; Xác định hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và enzyme α-glucosidase tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia thuộc Bộ Y tế; Đánh giá tính hiệu quả được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu và sản xuất động vật thí nghiệm chuẩn thức thuộc Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương; Xây dựng công thức, qui trình sản phẩm đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa từ cao chiết cỏ sữa lá lớn tại Công ty cổ phần rượu bia nước giải khát Aroma; Sản xuất thử nghiệm và đóng lon tại Viện nghiên cứu Rau quả và Đánh giá sự chấp nhận của cộng đồng tại Hà Nội và Hưng Yên.

3.    Phương pháp nghiên cứu

3.1. Khảo sát đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật Mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học; Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, lá; Mô tả đặc điểm bột thân, lá, hoa, quả. Chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu và bột bằng máy ảnh Canon. Xử lý ảnh bằng phần mềm PHOTOSHOP CS6.

- Định tính các nhóm hợp chất bằng phản ứng hóa học. Định tính các phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform, ethyl acetat bằng sắc ký lớp mỏng. Định lượng flavonoid có trong cây cỏ sữa lá lớn bằng phương pháp đo quang

3.2. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm trong kiểm soát glucose máu

-  Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều chế cao cỏ sữa lá lớn: Áp dụng phương pháp định lượng hợp chất flavonoid toàn phần theo phương pháp đã được xây dựng. Sử dụng phương pháp thay đổi một nhân tố, các nhân tố khác giữ nguyên, sau khi chọn được giá trị thích hợp của nhân tố đó thì giá trị này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

-  Đánh giá tính an toàn của cao cỏ sữa lá lớn: Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn.

-  Đánh giá hiệu quả kiểm soát glucose máu của cao cỏ sữa lá lớn: Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase in vitro và đánh giá tác dụng kiểm soát glucose máu trên mô hình động vật thực nghiệm

3.3.  Ứng dụng cao cỏ sữa lá lớn thử nghiệm sản xuất đồ uống dinh dưỡng dùng trong kiểm soát glucose máu

-  Phương pháp công nghệ: Lựa chọn công thức; Phương pháp nghiên cứu bao bì đóng gói; Phương pháp xác định thời gian thanh trùng;

-  Phương pháp kiểm nghiệm: Chỉ tiêu hóa lý và vi sinh;

-  Đánh giá chất lượng, an toàn thực phẩm: Đánh giá chất lượng, an toàn thực phẩm theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống không cồn QCVN 6-2:2010/BYT và Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7041:2009 về đồ uống không cồn

-  Xác định hiệu suất điều chế: Hiệu suất chiết được xác định bằng tỷ lệ của khối lượng cao chiết thu được so với khối lượng bột dược liệu được tách chiết

-  Đánh giá sự chấp nhận của cộng đồng: Sản phẩm đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa khi sản xuất thử nghiệm được đánh giá sự chấp nhận của cộng đồng bằng phép thử cho điểm thị hiếu

KẾT QUẢ VÀ KẾT LUẬN

1.    Cỏ sữa lá lớn tại Bình Dương đã được nghiên cứu và xác định có tên khoa học là Euphorbia hirta L., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Phần trên mặt đất cỏ sữa lá lớn có chứa: flavonoid, saponin, tanin, alcaloid, đường khử, polysaccharid, sterol. Nhóm flavonoid chứa chủ yếu là quercitrin. Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercitrin là 0,375 ± 0,014 % trong dược liệu khô tuyệt đối.

2.    Điều kiện thích hợp cho điều chế cao chiết nước cỏ sữa lá lớn là: Kích thước 2-3cm; chiết xuất 3 lần với tỷ lệ dược liệu/dung môi 10/8/8 trong thời gian tương ứng 2,5h/2h/1,5h ở nhiệt độ chiết 95⁰C, sau đó cô trên bếp cách thủy ở 70⁰C. Hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 20-21 mg/g cao khô (độ ẩm ≤ 5%). Cao cỏ sữa lá lớn đã được xác định đảm bảo an toàn trên động vật thực nghiệm. Khả năng ức chế hoạt động của enzyme α-amylase và α-glucosidase với giá trị IC50 tương ứng được xác định là 967 µg/mL và 53,96 µg/mL. Sử dụng cao chiết cỏ sữa lá lớn liều 500 mg/kg thể trọng trong 8 tuần có tác dụng hỗ trợ giảm glucose máu trên chuột đái tháo đường thực nghiệm.

3.    Quy trình sản xuất thử nghiệm đồ uống dinh dưỡng từ cao chiết cỏ sữa lá lớn đã được xây dựng với công thức (cao Cỏ sữa lá lớn 25 g/L, mật ong 25 g/L; chất tạo ngọt 0,3 g/L; gừng 10 g/L); Đóng lon 200ml; Thanh trùng ở điều kiện 90⁰C trong 10 phút đã tạo ra sản phẩm có hàm lượng flavonoid toàn phần là 80,3 mg/100ml, đạt chất lượng, an toàn thực phẩm. Sản phẩm được đánh giá cao bởi người tiêu dùng (85,7% thích màu, 89,8% thích mùi hương và 87,7% thích vị).

KHUYẾN NGHỊ

1.    Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng và thử nghiệm trên cộng đồng về hiệu quả kiểm soát glucose máu, chống oxy hóa của đồ uống cỏ sữa lá lớn trong hỗ trợ phòng và điều trị bệnh đái tháo đường.

2.    Tiếp tục hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất đồ uống cỏ sữa lá lớn và ứng dụng ở qui mô công nghiệp.

3.    Đề nghị các cơ quan nghiên cứu và quản lý nhà nước quan tâm trong việc phát triển vùng trồng cây cỏ sữa lá lớn, nâng cao chất lượng nguồn thảo dược này ứng dụng trong chăm sóc và nâng cao sức khỏe của nhân dân.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng khoa học về đặc điểm thực vật và một số thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn phát triển tự nhiên tại Bình Dương, chứng minh được cơ chế làm giảm đường huyết của cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) là do khả năng ức chế các enzyme thủy phân carbohydrate như α-amylase và α-glucosidase và là cơ sở khoa học chứng minh tác dụng của cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) trong việc làm giảm chỉ số đường huyết ở chuột bị gây đái tháo đường ở qui mô thực nghiệm.

- Nghiên cứu đã xây dựng được qui trình công nghệ điều chế cao chiết cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) trên cơ sở xác định các điều kiện công nghệ phù hợp, từ chế phẩm này có thể dễ dàng điều chế các dạng sản phẩm khác nhau trong phòng chống bệnh đái tháo đường (dạng viên nang, bột hoặc đồ uống). Trong đó, tác giả đã thử nghiệm sản xuất thành công sản phẩm đồ uống dinh dưỡng giàu flavonoid  từ cỏ sữa lá lớn có nguồn gốc tự nhiên. Đây là lĩnh vực ở Việt Nam chưa phát triển nhiều, cần được đẩy mạnh trong thời gian tới, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

ABTRACT

Name of PhD candidate: Nguyen Manh Thang

Thesis’ title: “A research on making euphorbia hirta L. extract in application for producing nutritious food to control the glucose in blood”.

Specialization: Nutrition

Code: 9720401

Supervisor:  1. Prof. Dr. Nguyen Cong Khan.

2.Assoc. Prof. Dr. Truong Tuyet Mai

Education institution: The National Institute of Nutrition

CONTENT

INTRODUCTION

In recent decades, studies of plants that can help preventing and treating diabetes and diabetes complications are increasingly drawing the attention of scientists around the world. The asthma plant with the scientific name Euphorbia hirta L., belonging to Euphorbiaceae family, a wild plant that grows in humid lands in tropical countries, including the southern provinces of Vietnam. The field survey shows that Binh Duong is a province with satisfactory weather and soil conditions for the development of plants in the castor family. Many studies around the world such as India, Malaysia, and Japan have shown the effects of Euphorbia hirta L. plants on diabetes through the mechanism of controlling blood glucose, inhibiting enzymes α-amylase and α-glucosidase by conjugation. Flavonoids are found in this herb. Up to now, in our country, there are limited systematic studies on Euphorbia hirta L. applying this medicinal source to the production of nutritious food to meet the needs of public health care

OBJECTIVES

1. Describing the characteristics of the plants and determine some of the chemical components of the big leaf dairy plant.

2. Preparing and evaluating the safety and effectiveness of fenugreek in controlling blood glucose.

3. Building a technological process to produce nutritious beverages from large leaf milk grass used in blood glucose control.

RESEARCH CONTENT

1. Studying the botanical characteristics and analyzing some chemical components of the Euphorbia hirta L.

2. Working on the process of extracting Euphorbia hirta L., evaluating the safety and efficiency of the extract in controlling blood glucose.

3. Building a technological process to produce nutritious beverages from Euphorbia hirta L extract used in blood glucose control.

SUBJECTS AND METHODS OF RESEARCH

Main material

Euphorbia hirta L. plants,collected in Binh Duong province, dried to the humidity ≤ 11%, cut into segments 4-6 cm long and stored in a plastic bag, kept in a dry and ventilated place. The minimum time from harvesting to putting into experiments is 30 days. From this raw material, the author has conducted preparing Euphorbia hirta L. extract. In the study, the author uses a number of other materials such as: Honey, Ginseng, sweeteners, Cinnamon, Ginger, Water and aluminum package cans.

2. Research site

After directly field surveying the naturally grown Euphorbia hirta L. in Binh Duong, the researcher has collected the fresh (original) Euphorbia hirta L., washed it and transported it to Hanoi to conduct experiments. The author has carried out the following studies: Plant characteristics and chemical components of Euphorbia hirta L. in the Department of Medicinal Materials, Hanoi University of Pharmacy; Euphorbia hirta L. preparation at the Department of Plant Chemistry under the Institute of Medicinal Materials; Evaluation of acute and semi-chronic toxicity in the Department of Pharmacology and Biochemistry of the Institute of Medicinal Materials; Determination of inhibitory activity of α-amylase and α-glucosidase enzymes at the National Institute of Food Safety and Hygiene under the Ministry of Health; Efficiency evaluation was conducted at the Center for standard laboratory animal research and production under the National Institute of Hygiene and Epidemiology; designing the formula and process of nutritional beverage products from Euphorbia hirta L.extract at the Aroma Alcohol and Beverage Joint Stock Company; Test production and canning at the Institute for Fruit and Vegetable Research and Community Acceptance Assessment in Hanoi and Hung Yen.

3. Research method

3.1. Surveying the vegetative characteristics and chemical composition of the big leaf milky tree

- Research on plant features Describe morphological features and identify scientific names; Describe features of stem and leaf microsurgery; Description of stalks, leaves, flowers and fruits. Take photos of micro-anatomical features and powder with Canon camera. Image processing by software PHOTOSHOP CS6.

- Qualitative groups of compounds by chemical reactions. Qualitative n-hexane, chloroform, and ethyl acetate extracts by thin layer chromatography. Quantification of flavonoids present in large leaf dairy plants by photometric method

3.2. Extract of Euphorbia hirta L. preparation, evaluating the safety and effectiveness of the product in blood glucose control

- Investigating the factors affecting the preparation process of high leaf milk grass: Apply the method of quantifying total flavonoid compounds according to the established method. Using the one-factor change method, the other factors remain the same, after choosing the appropriate value of that factor, this value will be used for subsequent studies.

- Evaluation of the safety of large leaf clover extract: Assessment of acute and semi-chronic toxicity.

- Evaluate the glycemic control effect of the fenugreek: Investigate the inhibitory activity of α-amylase and α-glucosidase enzymes in vitro and evaluate the effect of blood glucose control in experimental animal models.

3.3. Euphorbia hirta L. application for the production of nutritional beverages for blood glucose control

- Technological method: Selection of formula; Packaging research methods; Method of determining the time of pasteurization;

- Test method: Physical and microbiological criteria;

- Evaluation of food quality and safety: Assessing food quality and safety according to the National Technical Regulations for non-alcoholic beverages QCVN 6-2: 2010 / BYT and Vietnam Standard TCVN 7041: 2009 on non-alcoholic beverages.

- Determination of preparation efficiency: The extraction efficiency is determined by the ratio of the extracted high mass compared to the extracted volume of medicinal powder.

- Community acceptance assessment: Milk grass nutrition drink products, when tested, were assessed for community acceptance by taste test.

RESULTS AND CONCLUSION

1. The asthma plant in Binh Duong has been studied and identified as Euphorbia hirta L., and Euphorbiaceae. The Euphorbia hirta L. contains: flavonoids, saponins, tannins, alkaloids, reducing sugars, polysaccharides, sterols. The flavonoid group contains mainly quercitrin. The total flavonoid content calculated as quercitrin is 0.375 ± 0.014% in absolute dry medicinal herbs.

2. The suitable conditions for the preparation of the extract of Euphorbia hirta L. extract are: Size 2-3cm; extract 3 times with the ratio of medicinal herbs / solvents of 10/8/8 in a corresponding time of 2.5 hours / 2 hours / 1.5 hours at the extraction temperature of 950C, then evaporate on a water bath at 700C. The total content of flavonoids reaches 20-21 mg / g dry extract (moisture ≤ 5%). Large-leaf milky extract has been determined for safety in experimental animals. The ability to inhibit the activity of the enzymes α-amylase and α-glucosidase with IC50 values was determined, respectively, 967 µg / mL and 53.96 µg / mL. Using Euphorbia hirta L. extract of 500 mg / kg body weight for 8 weeks has supported effect in reducing blood glucose in diabetic rats.

3. The production process for the Euphorbia hirta L. extract nutritious beverage has been formulated with the formula (Euphorbia hirta L. 25 g / L, honey 25 g / L; sweetener 0.3 g / L; ginger 10 g / L); 200ml cans; Pasteurization at 900C for 10 minutes has created a product with total flavonoid content of 80.3 mg / 100ml, achieving food quality and safety. Products are highly appreciated by consumers (85.7% like color, 89.8% like scent and 87.7% like taste).

RECOMMENDATIONS

1. Continuing research on clinical trials and community trials on the effectiveness of blood glucose control and antioxidant of large leaf milkshake drinks in supporting the prevention and treatment of diabetes.

2. Continuing to improve the technological process of milkshake beverage production and apply it on an industrial scale.

3. Recommending state management agencies to raise concerns about Euphorbia hirta L growing areas, improving the quality of this herbal source for use and improvement of the people's health care.

RESEARCH CONTRIBUTIONS

- The study has provided scientific evidences on the botanical characteristics and some chemical components of the naturally grown Euphorbia hirta L.plants in Binh Duong. It has been proved that the mechanism of reducing blood sugar of Euphorbia hirta L. is based on its ability to inhibit carbohydrate hydrolyzate enzymes such as α-amylase and α-glucosidase, which is the scientific basis of the effect of Euphorbia hirta L. in reducing the glycemic index of diabetic mice in experimental scale

- This research has built up a technological process to produce Euphorbia hirta L. extract by identifying the appropriate technological conditions. It is possible to prepare different types of products with ease in the prevention of diabetes (in the form of capsules, powders or drinks) from this extract. The author has successfully tested the production of flavonoid-rich nutritional beverage from the natural Euphorbia hirta L.. This field of research has not yet developed much in Vietnam, and should be promoted in the coming time in contribution to improving the public health.