Tối ưu hóa phản ứng rt-lamp phát hiện nhanh norovirus trong thực phẩm

2 lượt xem

Tạp chí Dinh dưỡng & Thực phẩm - Tập 12, Số 3, Năm 2016

(Link số tạp chí: https://tapchidinhduongthucpham.org.vn/index.php/jfns/issue/view/47)

Tác giả: Phan Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Hiền, Lê Quang Hòa

Tóm tắt

Norovirus là vi rút thuộc họ Caliciviridae, gây bệnh viêm dạ dày ruột ở người, đối tượng thực phẩm có nguy cơ nhiễm Norovirus thường là các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ và các loại rau quả ăn sống. Trong các phương pháp xác định Norovirus trong thực phẩm, phương pháp RT-LAMP là kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt cho phép phát hiện nhanh, chính xác với giá thành hợp lý. Tuy nhiên, các bộ mồi LAMP tính đến thời điểm hiện tại chưa đảm bảo độ bao phủ cao cho toàn bộ các kiểu gen của Norovirus. Do đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu hiệu chỉnh bộ mồi và tối ưu hóa phương pháp RT-LAMP xác định Norovirus trong thực phẩm. Để thực hiện mục tiêu này, các mẫu thực phẩm thu thập trên địa bàn các chợ tại Hà Nội được xử lý, sau đó tách chiết và tinh sạch ARN virus, phản ứng RT-LAMP được khảo sát để chọn ra điều kiện tối ưu (lượng enzyme phiên mã ngược 2U/phản ứng; nhiệt độ ủ 63°C; nồng độ Betain đối với GI: 1M, đối với GII: 0,8M; thời gian ủ: 60 phút) với độ nhạy là 10 phiên bản/phản ứng và độ đặc hiệu đạt 100% trên các chủng khảo sát.

Từ khóa: Norovirus, thực phẩm, RT-LAMP

Tài liệu tham khảo

1. Cục quản lý chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2014), Công văn 1349/QLCL-CL1 về việc lấy mẫu khảo sát Norovirus.

2. Trang, Nguyễn Vân (2013). Tác nhân tiêu chảy do virus ở trẻ em: Sự phân bố và tính đa dạng ở Việt Nam. Tạp chí Y học dự phòng. Tập XXIII (số 8 (144)), tr. 10-23.

3. Bo-Yun Yang, Xiao-Lu Liu, Yu-Mei Wei, Jing-Qi Wang, Xiao-Qing He, Yi Jin and Zi-Jian Wang (2014), Rapid and sensitive detection of human astrovirus in water samples by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye. BMC Microbiology. 14:38.

4. De-Guo Wang, Jeffrey D. Brewster, Moushumi Paul and Peggy M. Tomasula (2015), Two Methods for Increased Specificity and Sensitivity in Loop-Mediated Isothermal Amplification, Molecules. 20,tr. 6048-6059.

5. Hansman GS, Doan LT, Kguyen TA, Okitsu S, Katayama K, Ogawa S, et al (2004), Detection of norovirus and sapovirus infection among children with gastroenteritis in Ho Chi Minh City, Vietnam. Arch Virol. 149(1673-88).

6. Hung-Yueh YehT, Craig A. Shoe maker, Phillip H. Klesius (2005), Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63, tr. 36-44.

7. R.Boom.(Mar. 1990), Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. Journal of Clinical Microbiology . 28(3), tr. 495-503.

8. Shinji Fukuda, Shinichi Takao, Masaru Kuwayama, Yukie Shimazu, and Kazuo Miyazaki (Apr. 2006), Rapid Detection of Norovirus from

Fecal Specimens by Real-Time Reverse Transcription–Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay. Journal of Clinical Microbiology. 44(4), tr.1376–1381.

9. Tomoko Yoda, Yasuhiko Suzuki, KenjiYamazaki, Naomi Sakon, MasashiKanki, và Ikuko Aoyama, TeizoTsukamoto (2007). Evaluation and

Application of Reverse TranscriptionLoop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Noroviruses,Journal of Medical Virology.79, tr.326-334.

10.YangLi (2011), Loop-MediatedIsothermal Amplification (LAMP) forDetection of Three Enteric Viruses andIts Application in Water Samples, http://ysidata.com

Optimizing of rt-lamp method for fast detection of norovirus in food

Journal of Food and Nutrition Sciences - Vol.12, No.3, Year 2016

(Link to the journal issue: https://tapchidinhduongthucpham.org.vn/index.php/jfns/issue/view/47)

Author: Thi Thanh Ha PHAN, Thi Hien NGUYEN, Quang Hoa LE

Abstract

Norovirus, a virus of the Caliciviridae family, is the leading agent of food borne viral gastroenteritis worldwide. The most common foods contaminated by Norovirus are bivalve molluscan and raw vegetables. Among methods to detect Norovirus, RT-LAMP method is one of the most efficient low-costed isothermal amplifying techniques that provide rapid and exact specification. However the LAMP primer set does not always have sufficient specificity to detect all the various type of Norovirus. Therefore this study was conducted to optimize the LAMP primer set and RT-LAMP method. With the purpose of accomplishing this goal, the food samples which were collected from some markets in Hanoi were processed, followed by extraction and purification of viral RNA, then the RT-LAMP reaction was tested to select optimal conditions (concentration of reverse transcriptase enzyme: 2U / reaction; annealing temperature: 63°C; concentration of betaine for GI: 1M, for GII: 0.8M; incubation time: 60 minutes) with detective sensitivity 10 copies/reaction and specificity of 100% for tested strains.

Keywords: Norovirus, foods, RT-LAMP

References